wb封闭原理_wb封闭可以封闭多久

western blot中封闭起什么作用

转膜后，膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。

在做Western blot实验中，会用到固相载体(如NC膜，PVDF膜)，在这些固相载体表面有很多洞洞，通过电转，胶上的蛋白被转移到膜上，蛋白以机械填补(堆积)和吸附的方式结合于表面。

蛋白塞进了表面的很多洞洞里面，但是蛋白并不是连续的，而有很多空隙，抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样就会有很多非特异性的信号。

扩展资料：

封闭液中的蛋白可以与固相载体表面的空白位置结合，以机械填补(堆积)和吸附覆盖的方式结合在膜上，填补和覆盖蛋白结合位点以避免非特异性结合。同样，这两种作用使封闭液中的蛋白能够狠牢固结合在空白位置上，这样抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合。

封闭液应封闭所有的未结合位点而不替换表面上的靶蛋白，不结合靶蛋白表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。

转膜后，膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。

参考资料：

百度百科——蛋白印迹法western blot

 

wb实验的原理和步骤

WB实验是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将混合蛋白质样品分离后，利用特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质（例如PVDF膜）上。

再以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与相对应的第一抗体特异性结合，之后再与酶或同位素标记的第二抗体相结合，最终通过底物显色或放射自显影来检测特异性目的基因表达的蛋白成分。

扩展资料：

WB，蛋白质印迹（Western blotting）又称免疫印迹（immunoblotting）,是采用印迹技术将蛋白质转移到膜上，再根据抗原-抗体的特异性结合，检测复杂样品中的某种蛋白的方法，该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

一、蛋白样本提取制备

1 细胞或组织裂解

2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂

3 蛋白定量

4 电泳上样样品的准备

二、 电泳

1 PAGE 胶的制备

2 蛋白分子量 Marker

3 阳性对照

4 内参对照

5 上样与电泳

三、 转膜与显色（ Western Blot）

1 胶中蛋白的检测

2 蛋白转膜

3 膜上蛋白的检测：丽春红

4 膜的封闭

5 一抗的孵育

6 二抗的孵育

7 显色

四、常见问题分析与解决方案

五、试剂及缓冲液配方

一、蛋白样本提取制备

蛋白样品制备是 Western Blotting 的第一步，是决定 WB 成败的关键步骤之一。

蛋白提取总体原则与注意事项包括：

1) 尽可能提取完全或降低样本复杂度使得集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）。

2) 保证蛋白处于可以溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度、 表面活性剂、还原剂等的选择实现）。

3) 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等（全程保证在冰盒中低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）。

4) 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）。

5) 样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。

做wb实验时为什么要用脱脂奶粉的tbst封闭转移膜两小时

封闭的概念是，首先pvdf膜与所有蛋白是有很强的结合力，包括抗体，蛋白电泳转膜后，pvdf膜上会结合分离的蛋白，但这些蛋白的数量比较少，不足以饱和膜上所有的蛋白结合位点，如果不封闭直接孵育抗体，抗体就会与这些位点结合，所以需要用杂蛋白封闭膜上的空余位点。封闭相当于在膜上覆盖一层蛋白，这样抗体与膜本身之间就没有结合力了，只会与膜上特异性的蛋白结合，从而实现特异性的免疫识别。

封闭后的最好可以洗涤一下